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在細(xì)胞療法朝著通用型、攻克實(shí)體瘤的大發(fā)展趨勢(shì)下，CAR-NK療法已然處于“風(fēng)口”。近年來，CAR-NK療法的研發(fā)不斷升級(jí)加速，其CAR結(jié)構(gòu)也經(jīng)歷了多次迭代，基于不同的跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)共刺激域的模塊化組合的優(yōu)化結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，CAR-NK細(xì)胞的效力和持久性得到有效提升。

 

CAR-NK的CAR通常由三部分組成：胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域以及胞內(nèi)激活結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域由信號(hào)肽、識(shí)別抗原的單鏈抗體片段（scFv）和鉸鏈區(qū)組成。這些結(jié)構(gòu)的組合連同調(diào)控元件（例如啟動(dòng)子）將決定CAR的功效。

 

 

 

四代CAR-NK

 

 

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載體骨架和啟動(dòng)子
載體骨架包含表達(dá)CAR所需的所有元件，包括啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控片段和聚腺苷酸化信號(hào)（polyA信號(hào)）。特定啟動(dòng)子的選擇對(duì)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平有直接影響，且可能受到scFv序列本身的影響。目前，尚難以確定CAR-NK細(xì)胞的最佳啟動(dòng)子。但已有研究報(bào)道，在原代CAR-NK和CAR-NK細(xì)胞系中，病毒啟動(dòng)子（如CMV、MPSV、MMLV、SFFV等）比組成型活動(dòng)啟動(dòng)子（如EF1α、PGK）更常用。

 

2
信號(hào)肽
CAR序列從一個(gè)短信號(hào)肽（SP）開始，信號(hào)肽中存在著巨大的異質(zhì)性，這與不同水平的蛋白質(zhì)分泌效率相關(guān)。目前CD8a-SP是原代NK細(xì)胞最常用的信號(hào)肽序列。盡管信號(hào)肽序列可能影響CAR的表達(dá)水平，但目前還沒有數(shù)據(jù)確定CAR-NK的最佳SP。

 

3
單鏈抗體片段（scFv）
scFv是CAR的腫瘤抗原結(jié)合域，不同的scFv可以結(jié)合相同蛋白質(zhì)的不同表位，該結(jié)構(gòu)域與CAR-NK細(xì)胞的特異性和功能有關(guān)。scFv的輕鏈和重鏈順序是人為確定的，對(duì)于CAR-NK的設(shè)計(jì)，大部分研究人員更偏向于VH-VL方向。有研究表明，即便是靶向相同抗原的scFv也會(huì)影響CAR表達(dá)的結(jié)果。

 

而單個(gè)免疫細(xì)胞可以配備多個(gè)scFv，這也擴(kuò)大了CAR效應(yīng)細(xì)胞識(shí)別抗原的能力。CAR-T細(xì)胞療法上的做法或許可以提供參照：一種是CAR可以選擇具有雙順反子原件的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)兩種CAR的表達(dá)；另一種可以將兩個(gè)scFv融合到一個(gè)構(gòu)建體中，從而產(chǎn)生串聯(lián)的scFv或“sing stalk”CAR。盡管無論是鼠源的還是人源的單鏈抗體，都有可能誘導(dǎo)宿主抗獨(dú)特型抗體的免疫反應(yīng)，但從目前所做的臨床研究來看，尚未在CAR-NK試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)與抗CAR免疫反應(yīng)相關(guān)的重大副作用。

 

4
連接區(qū)
將重鏈與輕鏈進(jìn)行連接的連接區(qū)可以穩(wěn)定scFv的構(gòu)象，部分決定了CAR識(shí)別靶表位的能力。對(duì)于CAR-NK而言，五肽GGGGS的多聚體應(yīng)用最為廣泛，另一種常用的是Whit low“218”。

 

5
鉸鏈區(qū)
鉸鏈區(qū)負(fù)責(zé)將scFv連接到跨膜結(jié)構(gòu)域，通常維持效應(yīng)細(xì)胞中CAR表達(dá)和活性的穩(wěn)定性。大部分CAR-NK采用的是CD8α或CD28胞外結(jié)構(gòu)域的衍生物或基于IgG的鉸鏈區(qū)。而CD28相較于CD8α更能促進(jìn)細(xì)胞分子二聚化，使得CAR的激活刺激更強(qiáng)，但也可能導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放綜合征。基于IgG鉸鏈區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)，其構(gòu)建更具靈活性。目前，大部分原代NK細(xì)胞、CAR-NK細(xì)胞系使用的是CD8α鉸鏈區(qū)。

 

6
跨膜（TM）結(jié)構(gòu)域
跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)AR的胞外域連接到胞內(nèi)激活結(jié)構(gòu)域，TM結(jié)構(gòu)域的選擇影響了CAR結(jié)構(gòu)在功能上活化的程度，其具體來源將決定CAR-NK的活性。最佳的TM結(jié)構(gòu)域應(yīng)該遵循T細(xì)胞或NK細(xì)胞上跨膜蛋白的天然取向（N-端到C-端的順序）。目前，CD8α和CD28衍生的TM結(jié)構(gòu)域在原代CAR-NK細(xì)胞中最為常見，CD28是CAR-NK細(xì)胞系的首選。

 

下一代CAR-NK

通過對(duì)上述各個(gè)結(jié)構(gòu)域的優(yōu)化，CAR-NK的CAR分子已經(jīng)發(fā)展至第四代。第一代CAR分子包含一個(gè)合成的細(xì)胞外受體、一個(gè)跨膜域和一個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)域；第二代和第三代的CAR分子分別具有一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域，共刺激分子通常來源于CD28家族、TNFR家族或SLAM相關(guān)受體家族。

 

有研究小組構(gòu)建了具有CD28和4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的第三代CD33靶向CAR，并轉(zhuǎn)導(dǎo)了NK-92衍生的NK細(xì)胞。在1期研究中給3名R/R AML患者回輸，結(jié)果證明了該療法的安全性，但未獲得持久的療效，這一結(jié)果歸因于受輻射的NK-92細(xì)胞在體內(nèi)的持久性有限。故而研發(fā)人員正探索更多樣化的CAR-NK療法，以解決其存在的局限性。

 

 

CAR-NK升級(jí)

 

 

 

 

前三代CAR結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)依賴于生理上發(fā)生的免疫細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域，而第四代CAR又被稱為“武裝”CAR，則采用了一種截然不同的方法，加入了分子有效載荷，賦予CAR工程細(xì)胞額外的特性和功能，以解決免疫細(xì)胞療法存在的固有限制。此外，還有雙特異性/多特異性靶向CAR、邏輯門控CAR等多種經(jīng)過優(yōu)化升級(jí)的CAR類型。

 

 

 

 

 

7大工程化策略

 

 

 

這些“下一代”CAR-NK療法主要采用了7大工程化策略以提升持久性和抗腫瘤活性：

 

 

1
第四代CAR-NK
第四代CAR-NK可以包含多個(gè)理想的基因修飾，比如添加IL-15細(xì)胞因子基因，以保持CAR-NK在體內(nèi)的持久性和抗腫瘤活性。CAR-NK賽道的頭部企業(yè)Nkarta曾稱其先導(dǎo)產(chǎn)品NKX101為“第四代”CAR-NK療法，NKX101的CAR經(jīng)過工程改造，可表達(dá)與共刺激（OX2）和信號(hào)傳導(dǎo)（CD40ζ）結(jié)構(gòu)域融合的嵌合NKG3D受體，這一受體能夠在目標(biāo)腫瘤細(xì)胞中找到最多8種相關(guān)配體。此外，NKX101還表達(dá)白細(xì)胞介素-15作為自分泌生長(zhǎng)因子，從而增加持久性。

 

目前，第四代CAR-NK的研究較少，clinicaltrials.gov官網(wǎng)已顯示有多條第四代CAR-T療法的相關(guān)研究，CAR-T療法的進(jìn)展較CAR-NK快，其CAR結(jié)構(gòu)有著共通之處，在CAR的加載技術(shù)更加成熟后，想必第四代CAR-NK的研發(fā)將會(huì)更加順利。

 

2
雙特異性/多特異性CAR-NK
實(shí)體瘤具有高度異質(zhì)性，即使是同一個(gè)病灶的腫瘤也可能表達(dá)不同的腫瘤相關(guān)新抗原，單一靶向的細(xì)胞療法往往面臨著挑戰(zhàn)，而雙特異性/多特異性靶向的方法有望解決異質(zhì)性問題，猶如編織了一個(gè)更大的“網(wǎng)”，將更多腫瘤細(xì)胞一網(wǎng)打盡。

 

目前，已有企業(yè)在探索雙特異性靶向CAR-NK。Cytovia Therapeutics曾宣布從CytoImmune獲得了其首創(chuàng)的用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和其他實(shí)體瘤的雙靶向CAR-NK的全球性產(chǎn)品權(quán)益。CytoImmune的創(chuàng)始人Michael A. Caligiuri博士及其團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一種能夠靶向表達(dá)EGFR野生型和/或突變EGFR vIII的的EGFR雙靶向CAR-NK，這一療法在動(dòng)物模型中顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著改善。

 

另外，Jeffrey Miller團(tuán)隊(duì)曾在2021年報(bào)道了其研究成果，構(gòu)建了一種多特異性B7-H3靶向的iPSC來源的CAR-NK，具有廣譜抗癌的潛力。不過這一概念較為前沿，真正落地還需要走很長(zhǎng)一段路。

 

3
邏輯門控CAR-NK
邏輯門控CAR也稱為非門CAR，這種CAR將腫瘤中缺失的抗原作為激活免疫系統(tǒng)的靶標(biāo)，能夠抑制T細(xì)胞與正常細(xì)胞上的抗原結(jié)合，從而有效避免“脫靶效應(yīng)”。

 

合成生物學(xué)大牛盧冠達(dá)創(chuàng)辦的Senti Bio曾在2021年舉辦的第36屆癌癥免疫治療學(xué)會(huì)年會(huì)上展示一種邏輯門控同種異體CAR-NK療法SENTI-401，將癌胚抗原（CEA）靶向激活CAR與抑制性CAR配對(duì)，后者負(fù)責(zé)識(shí)別在某些健康胃腸道和肺上皮細(xì)胞中獨(dú)特表達(dá)的安全抗原（SA），這一設(shè)計(jì)能夠靶向和殺死表達(dá)CEA的腫瘤細(xì)胞，同時(shí)避開表達(dá)CEA的健康上皮細(xì)胞。

 

在臨床前評(píng)估中，SENTI-401能夠有效殺死大腸癌細(xì)胞，并保護(hù)健康細(xì)胞，同時(shí)降低了毒性。2023年1月，Senti Bio宣布將優(yōu)先推進(jìn)邏輯門控細(xì)胞療法SENTI-401和SENTI-202。值得一提的是SENTI-202也是一種邏輯門控現(xiàn)成的CAR-NK細(xì)胞候選產(chǎn)品，旨在靶向和消除AML細(xì)胞，同時(shí)保留健康的骨髓，預(yù)計(jì)將在今年下半年提交IND申請(qǐng)。

 

 

 

2022年7月，德克薩斯大學(xué)MD安德森癌癥中心的研究人員在Nature Medicine上發(fā)表了一篇文章報(bào)道了一種。研究人員發(fā)現(xiàn)“胞啃”的生理過程通過引起腫瘤抗原丟失、NK細(xì)胞衰竭和自相殘殺，促成了腫瘤逃逸和CAR-NK細(xì)胞治療后反應(yīng)不佳。在這一過程中，靶細(xì)胞表面蛋白會(huì)轉(zhuǎn)移到免疫細(xì)胞表面以引發(fā)自相殘殺的現(xiàn)象。

 

研究人員給CD19 CAR-NK細(xì)胞添加了一種旨在識(shí)別NK細(xì)胞特有的標(biāo)志物的抑制性CAR，即使NK細(xì)胞表面攜帶腫瘤抗原，也可以通過第二個(gè)CAR向同類表達(dá)“不要?dú)⑽?rdquo;的信號(hào)。在臨床前腫瘤模型中，邏輯門雙靶向CAR-NK能夠更好地聚集腫瘤細(xì)胞，減少了NK細(xì)胞耗竭及自相殘殺。

 

 

總結(jié)

盡管當(dāng)下尚未有CAR-NK療法獲批上市，但其在治療實(shí)體瘤中的優(yōu)勢(shì)使得這一療法備受期待。一位CAR-T研發(fā)人員曾表示：“人們對(duì)后來上市的CAR-T療法往往有更多的期待，所以我們?cè)谝淮鶦AR-T療法的同時(shí)也會(huì)推進(jìn)迭代產(chǎn)品的研究。”在其他賽道如TIL療法也不例外，TIL龍頭企業(yè)Iovance除了申報(bào)其核心管線LN-144外，已經(jīng)布局了第三代TIL療法。同理，CAR-NK療法亦如是，想必隨著CAR的結(jié)構(gòu)升級(jí)，CAR-NK療法的療效和安全性也將大大提升。

 

 

 

來源：醫(yī)麥客